头孢他啶-阿维巴坦被视为是一种有希望的对丝氨酸β-内酰胺酶（包括肺炎克雷伯菌碳青霉烯酶，KPCs）有活性的β-内酰胺-β-内酰胺酶抑制剂。尽管在世界范围内对头孢他啶-阿维巴坦的使用有限，但已有报道，在没有头孢他啶-阿维巴坦治疗史，或在短暂使用头孢他啶-阿维巴坦治疗后的患者中出现头孢他啶-阿维巴坦耐药。

我们在近期的一项研究中，描述了在中日友好医院使用头孢他啶-阿维巴坦治疗9名感染产KPC酶肺炎克雷伯菌(Klebsiella pneumoniae carbapenemase-producing Klebsiella pneumoniae , KPC-KP) 肺移植患者的经验。尽管在使用头孢他啶-阿维巴坦治疗肺移植患者KPC-KP中表现出高比例的临床治愈率、生存率和安全性，在13-22天治疗后，4名患者出现了头孢他啶-阿维巴坦耐药。在本文中，我们使用基因组学和分子遗传学方法识别和验证KPC-51和KPC-52，这两种导致头孢他啶-阿维巴坦耐药的新型KPC-2突变的耐药机制。

根据CLSI标准采用微量肉汤稀释法进行药敏实验。收集同一患者头孢他啶-阿维巴坦治疗前后分离出的肺炎克雷伯菌，分别记为A和B（图1）。共收集5名患者的10株肺炎克雷伯菌（包含对头孢他啶-阿维巴坦耐药的4株菌）用于表型及基因型分析。

这10株KPC-Kp菌株使用Illumina NovaSeq 系统进行全基因组测序。基因分析显示这10株菌均为ST11克隆背景。6株菌（1A,1B,7A,7B,8A和8B）的荚膜型为KL47 (wzc: 47, wzi: 209)，4株菌(3A, 3B, 5A和5B)的荚膜型是KL64 (wzc: 64, wzi: 64)。这10株菌根据系统发生分析可以分为3个分支，同一患者分离的菌株显示出克隆相关性。10株肺炎克雷伯菌均携带碳青霉烯酶基因（blaKPC）。6株头孢他啶-阿维巴坦敏感株（1A, 3A, 5A, 5B, 7A 和 8A）携带野生型blaKPC-2， 而4株头孢他啶-阿维巴坦耐药株（1B, 3B, 7B, 和8B)携带突变的blaKPC-2。在这4株菌中发现了以下3种KPC-2突变体。(i)KPC-33（3B和8B），在氨基酸179位酪氨酸替代天门冬氨酸（D179Y）。(ii)KPC-51(1B), 一种有三重替换的新型KPC-2突变体(D179N/Y241H/H274N)，在氨基酸179位天冬酰胺替代天门冬氨酸（D179N），在氨基酸241位组氨酸替代酪氨酸(Y241H)，在氨基酸274位天冬酰胺替代组氨酸(H274N)。(iii) KPC-52(7B)，另一种新型KPC-2突变体，在氨基酸179位酪氨酸替代天门冬氨酸（D179Y），在氨基酸262位和263位之间插入缬氨酸。

携带野生型blaKPC-2的肺炎克雷伯菌对碳青霉烯耐药，对头孢他啶-阿维巴坦敏感。而携带突变型blaKPC-2的肺炎克雷伯菌（1B,7B和8B）对头孢他啶-阿维巴坦耐药，并降低了碳青霉烯的MICs（亚胺培南MIC 1-2mg/L, 美罗培南MIC 2-4mg/L）。值得注意的是，携带突变型blaKPC-2的菌株3B，表现为同时对头孢他啶-阿维巴坦（MIC,256mg/L）和碳青霉烯（亚胺培南 MIC，64mg/L；美罗培南 MIC 256mg/L）的高水平耐药。此外，我们在菌株3B的NGS数据中发现了野生型KPC和突变型D179Y同时存在。在1228 reads中，349（28.4%）reads属于野生型（KPC-2），879（71.6%）reads包含D179Y突变（KPC-33）。已有研究报道，blaKPC-2 和 blaKPC-33同时存在可以导致更高的碳青霉烯MICs。

通过质粒转化和blaKPC-2克隆验证KPC-51,KPC-52的耐药机制。与野生型blaKPC-2转化子相比，含KPC-2突变的转化子表现为头孢他啶-阿维巴坦MICs升高（2-32mg/L），但不同KPC-2突变体引起的MIC升高水平并不相同。 3B(KPC-33 和KPC-2)和8B（KPC-33）的转化子仅引起头孢他啶-阿维巴坦MICs（2mg/L）的轻度升高，未达到耐药水平。而7B（KPC-52）的转化子导致更高的头孢他啶-阿维巴坦MIC(32mg/L)，这可能与该菌中的新插入（氨基酸262位和263位之间插入缬氨酸）有关。该新插入对头孢他啶-阿维巴坦耐药表型的作用还需进一步研究。有趣的是，产KPC-51的肺炎克雷伯菌临床分离株（1B）的头孢他啶-阿维巴坦MIC是最高的（2048mg/L），但KPC-51大肠杆菌DH5α转化子的头孢他啶-阿维巴坦MIC较低（8mg/L）。这些结果表明blaKPC-2突变不是导致KPC突变株头孢他啶-阿维巴坦MIC升高的唯一原因。我们推测，这些肺炎克雷伯菌临床分离株可能会存在其他耐药机制，比如膜孔蛋白缺失等。更多关于菌株的确切耐药机制例如KPC 拷贝数，ompK35突变，新插入（7B中氨基酸262位和263位之间插入缬氨酸）和新替换（1B中D179N/Y241H/H274N）的作用正在研究中。

总之，我们的数据扩展了对头孢他啶-阿维巴坦耐药的理解。考虑到头孢他啶-阿维巴坦已经被中国食品和药物管理局批准临床应用，并可能会在中国广泛使用，希望我们的研究可以引起临床医生对该药的重视，使其有效地应用于临床。

图1. 10株肺炎克雷伯菌微生物学和分子特征

注：CZA：头孢他啶-阿维巴坦；IMP：亚胺培南；MEM：美罗培南；KPN：肺炎克雷伯菌。菌株A和B分别代表同一患者患者使用头孢他啶-阿维巴坦前后分离出的肺炎克雷伯菌。

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