​2019 年 1 月，业界权威期刊——美国呼吸与危重症医学杂志（American Journal of Respiratory and Critical Care Medicine, 2018 年影响因子 16.494）刊登了美国贝勒大学医学中心（Baylor University Medical Center）-南非开普敦大学肺感染与免疫学中心 Tawanda Gumbo 教授科研团队的研究论文 Spatial Network Mapping of Pulmonary Multidrug-Resistant Tuberculosis Cavities Using RNA Sequencing（基于 RNA 测序技术构建的耐多药结核病空洞空间网络图谱）。该论文在世界上首次报道了对耐多药结核病（MDR-TB）患者的转录组学研究，并阐释了不同解剖学位置上的结核性空洞产生的病理生理学机制。

I. 研究背景：

结核分枝杆菌（Mtb）的耐药性是一个重要的公共卫生问题，威胁到 DOTS（直接督导化疗策略）的成功实施，也威胁到全球结核病控制。目前，医学界对于结核病患者对 Mtb 的保护性免疫和结核菌的关键传播机制——肺结核性空洞的产生于发展机制尚不清楚。而且此前的研究大多数都集中于肺结核性肉芽肿，很少有科学家关注肺结核性空洞。

II. 科学问题：

Tawanda Gumbo 教授团队发现近期来自南非的 MDR-TB 患者病例报告显示，患者的肺结核性空洞边缘免疫功能失效，根本无法控制 Mtb 在肺结核性空洞病变部位的生长。产生该现象的原因尚不清楚，研究团队推测，很可能是 Mtb 自身在感染中释放了某种具有较强免疫抑制作用的因子，或者是它可以直接杀死了免疫细胞。因此亟待解决的重要科学问题是：为什么 MDR-TB 患者的免疫系统会「失效」？MDR-TB 患者形成肺结核性空洞的分子机制是什么？

III. 研究方法：

针对这些科学问题，该团队设计并进行了一项病例对照临床研究实验。对 MDR-TB 患者，他们选取了 7 个不同解剖学位置的肺腔内样本（①距纤维化空洞边缘 2-5 cm 的正常肺组织；②纤维化空洞的边缘；③空洞壁的中心；④空洞壁的内腔边缘；⑤空洞壁的内腔中心的空气接触界面；⑥≥ 2.5 cm 的远端呼吸道；⑦口腔的近端）以及痰液，共 8 种样本分别进行了活检组织的 RNA 测序（RNA-Seq），并将其与非 MDR-TB 受试者的健康的肺组织以及痰（对照组）进行比较并进行了动态建模分析。两组中均有少量同时感染 HIV 并接受治疗的受试者。实验组和对照组人员的实验入组情况见表 1。

IV. 结果：

1. 全部样品的 RNA 测序结果经过分析和比对后，共鉴定到 19,049 个基因，其中 31.07 % 是剪接变体。对实验组和对照组的所有样本进行主成分分析，发现数据分类聚合为四个群：①非 MDR-TB 受试者样本（对照组）；②MDR-TB 患者的正常肺组织；③MDR-TB 患者的肺部三个空洞壁位置的样本（中心、内腔边缘、内腔中心的空气接触界面）；④MDR-TB 患者的正常肺组织中独特的空洞中心样本亚群（图 1）。

图 1. 对 MDR-TB 患者组和对照组所有 RNA 测序样本的主成分分析（PCA）

2. 基于主成分分析的结果，科研人员将所有的 RNA 测序样本分配到六个组中：①对照组；②MDR-TB 患者的正常肺组织；③MDR-TB 患者的肺部空洞壁；④MDR-TB 患者的肺部空洞壁-空气接触界面；⑤痰液；⑥呼吸道。然后他们找出六个分组的样本中存在的显著性差异表达的基因，标准为：变化倍数的|log2|＞2.0 并且 Benjamini-Hochberg 检验校正 p < 0.01（变化倍数是与非 MDR-TB 受试者样本相比，而不是与 MDR-TB 患者的正常肺组织相比）。接下来，科研人员针对选取出的显著性差异表达的基因进行了生物功能富集分析和信号通路富集分析（Enrichment Analysis），找到了其他五个组与对照组相比产生了显著性差异变化的信号通路。为了体现数据筛选的无限制性（No-barriers），科研人员并没有局限于与免疫调控相关的通路。其中，60 个最高的差异表达的信号通路富集热图见图 2（对照组没有显示）。

图 2. 60 个最高的差异表达的通路（用 log2 标度显示与对照组相比的倍数变化，例：6 代表 64 倍变化）

3. MDR-TB 患者的正常肺组织（图 2 中 Normal appearing 列）中显著性变化的信号通路数量最少，为 23.3 % [14/60]。值得注意的是，该组 RNA 测序样品富集分析出的丝氨酸/苏氨酸特异性蛋白激酶 C-θ（PKC-θ）信号通路中显示：①II 型主要组织相容性复合体（MHC-II）、T 细胞受体（TCR）及其下游的蛋白激酶 B（RAC）与对照组相比明显上调，这表明抗原提呈细胞（APC）与 T 细胞之间持续形成免疫突触来提呈并处理外源性抗原，并且刺激了 T 细胞的增殖；②和 PKC-θ信号通路相关的 NF-κB 通路和 c-JUN/c-FOS 转录信号通路与对照组相比明显上调，这表明 T 细胞抗凋亡增强（图 3）；③过氧化物酶体增殖物激活受体-α（PPAR-α）的上游信号传导基因：核受体辅激活因子（NCOA）和类视黄醇 X 受体（RXR）与对照组相比明显下调，这表明辅助性 T 细胞 17（Th17）的分化数量增加，而调节性 T 细胞（Treg）的分化数量减少，即很可能是 Th17 积极参与并且通过中性粒细胞启动了针对胞外菌的 3 型免疫应答来对抗 Mtb 的感染（图 4）。

图 3. MDR-TB 患者的正常肺组织中的 PKC-θ信号通路（紫色表示上调，绿色表示下调，以下皆同）

图 4. MDR-TB 患者的正常肺组织中的 PPAR-α的信号转导基因 NCOA 和 RXR 与对照组相比明显下调

4. MDR-TB 患者的结核性空洞壁（图 2 中 Cavity wall 列）中显著性上调的信号通路数量最多，为 78.3 % [47/60]。只有 PPAR-α、肝脏 X 受体（LXR）、视黄酸受体（RAR）、维生素 C 抗氧化激活、内皮型一氧化氮合酶（eNOS）等信号通路下调。与其他各组相比，该组样品中 IL-1、IL-6、IFN-γ等促进炎症的细胞因子的表达以及巨噬细胞产生一氧化氮和活性氧、NF-κB 激活等信号通路是上调最高的，这表明肺结核性空洞的产生可能与强烈的炎症反应有关。此外，髓样细胞表达的触发受体-1（TREM-1）信号通路明显上调，而且有 25.0 % [15/60] 的信号通路（如 PI3K/AKT、ERK/MAPK、NF-κB 等）与之呈正相关上调，这表明 TREM-1 及相关的 15 条信号通路共同形成的复杂调控网络是肺结核空洞产生的关键因素。

5. MDR-TB 患者的结核性空洞内腔中心-空气接触界面（图 2 中 Cavity Center 列）中显著性下调的信号通路数量最多，为 53.3 % [32/60]。最值得注意的是在 32 条下调的信号通路中，有 15.6 % [5/32] 是与神经内分泌相关的信号通路，包括：①多巴胺受体信号通路，三种多巴胺受体 DRD1、DRD2、DRD3 及其下游的甲状旁腺激素（PTH）和催乳素（PRL）等均明显下调（图 5）；②谷氨酸受体信号通路，离子型谷氨酸受体 GRM1、GRM5 表达下调并减弱了对磷脂酶 C（PLC）的激活；GRM2、GRM4、GRM7、GRM8 表达下调并减弱了对细胞内第二信使环磷酸腺苷（cAMP）级联放大的抑制；代谢型谷氨酸受体 GRM3 的表达也明显下调（图 6）；③突触长时程抑制（LTD）信号通路，磷脂酶 A2（PLA2）和蛋白激酶 C（PKC）下调表达，并且通过它们起作用的离子型谷氨酸受体α-氨基-3-羟基-5 甲基-4 异恶唑-丙酸受体（AMPAR）以及囊泡谷氨酸转运蛋白 17A（SLC17A）同样下调（图 7）。这表明在结核性空洞与空气的接触界面附近，存在着复杂的神经-内分泌-免疫调节反馈机制，且是通过神经、内分泌和免疫三大调节系统共有的化学信息分子（如神经递质多巴胺、谷氨酸等）及其受体实现的。

图 5. MDR-TB 患者的结核性空洞内腔中心-空气接触界面中的多巴胺受体信号通路与对照组相比明显下调

图 6. MDR-TB 患者的结核性空洞内腔中心-空气接触界面中的谷氨酸受体信号通路与对照组相比明显下调

图 7. MDR-TB 患者的结核性空洞内腔中心-空气接触界面中的突触长期抑制通路与对照组相比明显下调

6. MDR-TB 患者的呼吸道（图 2 中 Airway 列）中显著性下调的信号通路为 30.0 % [18/60]，显著性上调的信号通路为 60.0 % [36/60]。这组数据研究团队没有给予更多的分析，可能是作为整体实验的质控组。

V. 总结：

本文首次构建了 MDR-TB 患者的肺结核性空洞的不同组织区域的转录组学图谱，确定了几种迄今为止从未被科学界认识到的人类对 MDR-TB 产生免疫反应有关的信号通路，在一定程度上阐释了肺结核性空洞产生和免疫系统「失灵」的分子机制。本文进一步加深了人们对 MDR-TB 发病机制的认知，对 MDR-TB 的治疗有一定的意义。

供稿：余家沛 清华大学医学院

原文链接：https://www.atsjournals.org/doi/10.1164/rccm.201807-1361OC

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