近日，中国肺炎研究网(CAP-China)最新研究揭示人感染H7N9禽流感病毒关键位点在宿主内的动态变化规律，2018年4月24日在线发表于美国感染病协会(IDSA)官方杂志《感染性疾病杂志》(J Infect Dis)。
链接：https://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed/29688498
该研究由中日友好医院曹彬教授团队联合苏州大学附属第一医院，南昌大学附属第一医院完成。
研究背景
人感染禽流感H7N9自2013年在中国东南地区出现以后，迅速传播至其他多个省份。初期H7N9病毒对禽类低致病性，对人高致病性。自2017年1月初，广东地区发现了血凝素（HA）剪切位点突变的高致病性H7N9病毒。截止至2017年10月，H7N9病毒已造成全球1,565人感染，患者死亡率高达39%。
H7N9病毒持续进化和变异，并与中国禽类中广泛传播的H9N2病毒不断发生重配并不断产生新的基因型，形成了珠三角和长三角两个传播源头。H7N9病毒的关键位点，如耐药位点NA 292，哺乳动物适应位点PB2 627，在H7N9病毒感染人及其致病性方面起着关键作用。但是，H7N9病毒在宿主体内动态变化，特别是在抗病毒选择压力下的变异，是没有解决的重要科学问题。
研究方法和结果
本研究收集了中日医院，江苏大学第一附属医院，南昌大学第一附属医院的H7N9患者11名，动态采集患者的呼吸道样本，对其中的H7N9病毒进行二代测序。观察患者疾病进程不同时期病毒关键位点的动态变化。
H7N9病毒患者内的保守性
本研究共获得11名患者的29份样本的H7N9全基因组组序列，其中9名患者具有多个时间点的病毒序列信息。病毒在宿主内进化分析显示，同一患者的病毒在进化上呈现保守性，来自同一患者的病毒在进化树上形成一个分支，这说明同一个患者不同时间点的病毒类似，不同患者间的病毒差异性高于同一患者内多个时间点病毒之间的差异。在病毒的基因组片段水平，HA, PB1，PA，和NS1上的关键位点变异很少，其很少出现野生型和突变型共存的现象，大部分位点的变异均为均一性变异，同一位点混合存在多种突变的情况较少
图1 H7N9病毒的进化分析
抗病毒治疗下的耐药性变异
所有患者都接受了神经氨酸酶抑制剂抗病毒治疗。基于病毒的全基因组序列，本研究解析了H7N9病毒的神经氨酸酶（NA）上所有耐药位点变异信息，包括R118K，E119V，D151E，R152K，I222V，R224K，H274Y，E276D，R292K，N294S，和R371K（N2规则计数）。如R292K突变，当流感病毒NA蛋白第292位的氨基酸从精氨酸（简称R）突变成赖氨酸（简称K）时，流感病毒会对神经氨酸酶抑制剂类药物（如奥司他韦）出现耐药。在所有检测的耐药性突变中，R292K是出现最多的耐药性突变。在所有发生R292K突变的患者中，均为敏感的野生型292R和耐药的突变型292K毒株混合存在的情况。在2号和11号患者中，耐药性突变292K出现后又消失。在7号和9号患者中，耐药性突变292K毒株与292R敏感毒株混合存在，尽管在这个时期患者一直在进行抗病毒治疗，对奥司他韦敏感的耐药性毒株一直存在并未被清除掉。值得注意的是，9号患者第一份样本即发现了大量的耐药性突变，而这个时期患者并未开始抗病毒治疗，说明部分患者的耐药性突变并不是使用抗病毒药物治疗后选择压力产生的。其他类型的突变中，H274Y突变发生在一名患者中，未发现其他位点的耐药性突变。
图2. H7N9病毒耐药性位点R292K和哺乳动物适应位点PB2 E627K动态变化
哺乳动物适应性突变位点的变化
H7N9病毒属于禽流感病毒，在家禽中广泛传播，由于禽流感和人流感病毒识别的受体类型不同，一般而言，禽流感病毒并不容易传播到人，这也是大部分禽流感如H7N9，H5N1感染人的病例呈现散发性特点的原因。当禽流感病毒突破宿主屏障感染人（属于哺乳动物）时，禽流感病毒蛋白的一些位点会发生一些突变，如PB2蛋白627位从谷氨酸（E）到赖氨酸（K）的突变（用PB2 E627K表示），会导致禽流感病毒对哺乳动物受体的结合能力升高，病毒在哺乳动物体内增殖能力提高，这些位点突变称为禽流感病毒的“哺乳动物适应性位点突变”。本研究显示H7N9病毒感染的患者后病毒的一个重要哺乳动物适应位点PB2 627位发生了动态变化。在患者3和6中，PB2 E627K突变最终形成绝对优势并消除了野生型病毒PB2 627E。但在患者10和11中，PB2 E627K表现出了动态变化：在患者10中，野生型（627E）和突变型（627K）病毒持续混合存在，其比例在患者近10天的病程中变化不明显，在患者11中，野生型和突变型的比例发生着波动和反复，在观察的最后一个时间点，突变型病毒PB2627K数目未能取得优势。
结论
本研究利用二代测序技术阐明了H7N9禽流感病毒在感染患者后病毒基因组水平的动态变化，其中，NA 292 和PB2 627位点是变异的“热点”位置。尽管使用了神经氨酸酶抑制剂治疗且出现了NA R292K耐药性突变，但野生型病毒依然存在，且并未在抗病毒治疗压力下完全消失，这说明临床使用的奥司他韦等抗病毒药物对耐药性毒株的筛选并不是绝对的和完全的，敏感性毒株依然“顽强”存在，提示临床耐药毒株出现情况下抗病毒治疗依然有意义。同样的，H7N9病毒的哺乳动物适应位点PB2 E627K也发生着动态变化，表现出野生型和哺乳动物适应性的突变型共存的现象。这些结果提示H7N9病毒在感染患者后，其耐药性突变和哺乳动物适应性突变并不是单向和完全的，而是一种往复交替的动态变化。
致谢：感谢中日医院呼吸与危重症医学科 临床微生物实验室全体工作人员，感谢中国国家流感中心杨磊教授对二代测序数据分析的帮助。本研究得到国家杰出青年科学基金和国家重点研发计划的支持。
