传统上，肺炎的诊断是通过以不同类型的临床样本，如血液、痰、胸水等培养为基础的方法。然而，依赖培养的技术有几个缺点。例如，检测结果需要两到三天才能得到结果。此外，只有当病原体在宿主组织中仍然存活时，才能获得阳性诊断，而如果患者以前曾服用过抗生素，有时就不会发生这种情况。显微镜检查和血清学检测也常用于肺炎的诊断，特别是检测非典型病原体 (支原体属和衣原体属)。此外，基于特异性抗原-抗体反应的方法在该病的细菌学诊断方面取得了重大进展。例如，直接免疫荧光技术应用于肺炎患者的呼吸道样本，以能够开发肺炎链球菌快速检测[16]。

与传统培养方法相比，尿液中某些肺炎球菌抗原快速检测技术的开发进展显著 [17]。例如，肺炎链球菌溶血素是一种重要的肺炎链球菌毒力因子，已被证实是肺炎球菌肺炎诊断的相关标志物。不幸的是，检测这种抗原所需的免疫测定法目前还不能商业化。目前，有一种肺炎球菌多糖C尿液检测的商业诊断检测 (S. pneumoniae Binax Now®)。该检测用于成人，其中肺炎球菌肺炎的诊断具有可接受的特异性和敏感性 (95-80%)。然而，在儿童中这种检测的特异性较低，不能区分患病和无症状携带者儿童 [18]。因此，儿科医生在试图确定CAP患儿的病因时遇到了许多困难。在这种情况下，由于缺乏特异性和快速的诊断手段，肺炎的诊断主要基于胸部影像学以及经验性抗生素治疗。

近年来，传统的诊断方法得到了分子方法的补充，特别是核酸检测试验 (NATs)，如聚合酶链反应 (PCR)。这些技术，尤其PCR，在各种临床样本 (血液、胸腔积液和支气管肺泡灌洗液)中其诊断肺炎的速度和特异性方面具有显著进展。例如，利用NATs可以鉴定不同的CAP病原体。这些检测在肺炎支原体、军团菌属和肺炎衣原体方面获益明显。相反，由于在分析呼吸道样本时很难区分感染患者和带菌者，因此NATs在检测肺炎球菌方面是否优于传统技术尚不清楚 [19]。然而，研究人员继续开发新的检测技术尝试解决这个问题。例如，Bjarnason等 [20] 最近开发了一种使用成人肺炎患者口咽部样本的实时PCR检测方法。通过应用不同的临界值，作者可以成功地区分患者和携带者。的确该试验对肺炎链球菌的检测具有87% 的敏感性和79% 的特异性。因此，这种方法可以作为一种有用的手段认来证实通过其他方法所确定的诊断，尤其对于不能提供下呼吸道样本的患者 [20]。

值得注意的是，25% 的CAP患者有多种微生物 (或混合) 感染，其中几种微生物引起疾病。事实上，2019年发表的非洲和亚洲儿童健康肺炎病因学研究 (PERCH) 项目所进行的研究中确证了这种所观察到的混合感染趋势 [21]。考虑到这一点，为了提高疾病的病因诊断率，已经开发了几种多重PCR检测方法 [22]。在这种情况下，也许最相关的检测是用于分析咽部和鼻拭子的试验，包括一组病毒和细菌病原体，以提高住院儿童CAP患者病原学检测率[23]。Lee等 [24] 也开发了一种多重PCR方法，在ICU成人患者中可以鉴定引起肺炎的病原体及其主要耐药决定簇[24]。

尽管PCR有很多优势，但其缺点是需要专门的设备和合格的人员。相反，另一种基于核酸扩增的技术，环介导 (LAMP) 等温扩增 [25]，比传统的PCR便宜，可以由非专业人员操作，最重要的是不需要特定的设备。这种方法可用于检测病毒和细菌，因为DNA和RNA均可扩增。到目前为止，这项技术已被证明对肺炎支原体 [26] 和肺炎链球菌 [27] 等的检测有用。

目前最先进的技术方法，如宏基因组下一代测序 (mNGS)，已被提出作为多重病原体肺炎诊断的潜在解决手段。这一策略可能对儿童重症肺炎特别有用，尤其在获得其精确诊断方面具有挑战性 [28]。这项技术在检测引起疾病的病原微生物时提供了更高的敏感性，提供了有关菌株的额外信息，并有助于识别新的病原体。然而，应该注意的是，这项技术复杂且昂贵，此时并没有得到广泛应用。

另一种新的、充满前景的技术是使用微流体芯片，其由不同材料制成的小尺寸平台，可以使不同的诊断检测一体化，如PCR或LAMP，从而减少反应时间，有利于分散化的分析 [29]。已经有一些专门为肺炎诊断而设计的模型。例如，最近开发了一种用于肺炎链球菌和肺炎支原体即时检测的微芯片平台。采用随机抽取的63份口咽拭子和儿童支气管肺泡灌洗液标本，评价该平台的临床敏感性和特异性。与传统的肺炎链球菌PCR检测比较，这个平台被证明更敏感，更快，特异性更高 [30]。

肺炎预防：疫苗接种的影响

如上所述，细菌性肺炎，包括革兰氏阳性菌引起的肺炎，主要影响儿童和老年人。在这些人群中，有几个因素对这种疾病的发病率和死亡率产生影响。例如，充足的营养和纯母乳喂养有助于降低儿童和婴儿肺炎的发病率。一般来说，避免空气污染也被认为是一个重要因素，因为在污染的环境中观察到肺炎住院率的增加 [31]。尽管如此，免疫接种仍然是预防这种疾病的最有效方法。

20世纪80年代，多价肺炎球菌多糖疫苗已获准在美国使用。这种疫苗含有23种荚膜多糖，鼓励65岁以上的成人使用[32]。后来在2000年，一种7价肺炎球菌结合疫苗 (PCV7)，针对那些最常引起侵袭性肺炎球菌疾病的血清型设计，被引进用于儿童。目前，至少130个国家正在使用这种疫苗。自2009开始，也开发应用了两种肺炎球菌结合疫苗，PCV13 (Prevenar^TM13) 和PCV10 (SynflorixTM)。尽管由于血清型替代，一些疫苗未涵盖的血清型的流行率逐渐增加，但这些疫苗的广泛应用成功地减少了侵袭性肺炎球菌病。

目前正在开发几种针对金黄色葡萄球菌的疫苗，其中一些已经在临床前阶段成功地进行了检测。有些疫苗已经进入临床开发阶段，但遗憾的是还没有达到III期临床试验 [33]。

目前和未来的治疗策略

如前所述，肺炎大多根据其临床症状和体征诊断。因此，最常用的抗生素会覆盖最大可能的病原体。国际卫生当局推荐开始使用氟喹诺酮类(左氧氟沙星或莫西沙星) 或 β-内酰胺类(阿莫西林、氨苄西林、阿莫西林-克拉维酸、氨苄西林-舒巴坦、头孢噻肟或头孢曲松)加大环内酯类 (阿奇霉素或克拉霉素)。中度肺炎链球菌肺炎患者口服阿莫西林可能有效，而重症肺炎可能需要静脉应用头孢曲松、头孢噻肟或阿莫西林-克拉维酸 [34]。当证实存在金黄色葡萄球菌时，治疗通常包括青霉素类(苯唑西林和/或氟氯唑西林)。然而，MRSA菌株需要追加利奈唑胺或万古霉素治疗，尽管肾毒性和肺组织渗透性低是万古霉素的主要缺点。由于万古霉素和利奈唑胺都有相似的疗效，选择两者是基于病人的耐受性、肾功能和静脉通路 (利奈唑胺可用口服形式，而万古霉素首选使用选择性5-羟色胺再摄取抑制剂的患者)。最近，一种广谱活性的头孢菌素 (头孢他洛林) 已在美国和欧洲被批准用于治疗成人中重度CAP。此外，美国食品和药物管理局 (FDA) (2019年8月19日) 和欧洲药品管理局 (2020年5月26日) 批准了利法呋林(Lefamulin)用于治疗CAP，已证明对金黄色葡萄球菌、β-溶血性绿色链球菌、凝固酶阴性葡萄球菌、屎肠球菌、肺炎链球菌、流感嗜血杆菌、肺炎支原体、肺炎衣原体、肺炎链球菌、嗜肺军团菌和卡他莫拉菌。

抗生素的主要问题之一是其容易选择耐药的变异株。因此，有必要不断开发新的对非敏感菌株仍然有效的抗生素，或者设计新的抗菌策略。与抗生素一样，这些疗法中的一些药物也旨在杀灭病原体或抑制病原体在宿主体内的生长。例如，抗菌肽代表了一种有趣的替代传统抗生素药物，尽管在体外已经观察到细菌耐药性 [35]，但在体内是否也出现耐药性选择仍有待确定。将AMPs与外源性表面活性物质联合应用，可以使肽在肺中呈完全性分布。在一个针对MRSA和铜绿假单胞菌的表面活性剂-AMP混合物中，在体外成功地评估了四种悬浮在牛脂质提取物表面活性剂 (BLES) 中的AMPs (CATH-1、CATH-2、CRAMP和LL-37) [36]。细菌噬菌体也被重新发现作为有前景的抗菌剂，以及作为新型抗菌酶或酶生物的来源。噬菌体衍生抗菌素将是本综述下一节的重点，并将进行更深入的讨论。

在其他情况下，目的不是消灭病原体，而是限制其损害宿主的能力。众所周知，疾病的严重程度是由感染性病原菌分泌的一些毒素所产生的细胞损伤和炎症作用引起。因此，一些策略旨在中和这些毒素及其作用。在这种情况下，已经提出了抗体中和的几个分子靶点，主要针对于肺炎链球菌感染，包括肺炎链球菌溶血素PLY和胆碱结合蛋白PspA [37]，但尚未进行临床试验。反过来，在各种试验中已经成功地检测了抗葡萄球菌毒素的中和抗体。一个例子是人类单克隆IgG1抗体AR-301 (SalvecinTM，Aridis Pharmaceuticals，Inc，San Jose，CA，USA)，已在ICU临床试验中作为抗生素治疗金黄色葡萄球菌肺炎的补充疗法进行了评估[38]。单克隆抗体MEDI4893 (MedImmune，LLC，Gaithersburg，MD，USA) 也正在进行临床试验。进一步的例子包括2A3及其变异体LC10，它们降低了小鼠金葡菌肺炎模型的疾病严重程度 [39]和单克隆抗体LTM14，提供防御金黄色葡萄球菌[40]。关于杀白细胞素抗体，发现单克隆抗体ASN-1除了与Hla结合外，还与四种细胞毒素- LukSF-PV (Panton-Valentine leucocidin) 、LukED、HlgAB和HlgCB结合，而单克隆抗体ASN-2中和白细胞毒素LukGH。因此，两者进一步结合以实现更广泛的中和 (ASN-100，Arsanis，Inc.，Waltham，MA，USA) [41]。下一代单克隆抗体被设计为包括新的靶点，如金黄色葡萄球菌的agr成分 [42]。脂质体也被探索作为捕获成孔毒素的诱饵。这些制剂提高了菌血症模型中抗生素的治疗效果 [43]。防止病原体毒力的另一种策略是通过使用天然化合物，如黄酮类化合物 (黄芩苷、桑色素水合物) 来防止毒素的产生或组装 [44]。最后，另一种控制毒素相关损伤的方法是抑制宿主细胞受体以避免这些毒素的结合和摄取。这就是异羟肟酸抑制剂GI254023X的实例，其抑制Hla受体蛋白ADAM10，从而抑制毒素与真核细胞的结合，因此，在动物模型中降低毒性和病变大小[45]。

抗细菌性肺炎的另一种有趣的手段是免疫调节，即利用免疫系统对抗微生物的能力，同时减少对感染的炎症反应。一些免疫调节剂包括防御调节肽和免疫成分的激动剂，如Toll样受体和NOD样受体，甚至某些微生物信号传导分子 (N-酰基高丝氨酸内酯和环核苷酸) [46]。

最后，但很重要，值得注意的是，对微生物群平衡与人类健康之间关系的日益了解也为疾病治疗的新策略打开了大门。然而，与肠道菌群不同的是，对健康个体的肺微生物群知之甚少。因此，令人感兴趣的是识别那些共存生微生物对防御肺部病原体是有益的。

噬菌体是对抗肺炎致病菌的新武器

噬菌体疗法是治疗革兰氏阳性菌肺炎的一种有前景的选择，尤其对抗生素产生耐药的病原体。与其他类型的抗菌药物相比，噬菌体具有一些有趣的优势，例如在自然界丰富存在，在治疗过程中具有繁殖的能力，其对人类健康和环境的安全性以及对大多数抗生素缺乏交叉耐药性 [47]。

就肺炎链球菌来说，已确认感染该菌株的几种细菌噬菌体[48]，但由于大量的温和噬菌体及其在大多数临床分离株中的存在，噬菌体治疗的研究主要集中在使用细胞内溶素 (见下文)。

相反，在感染动物模型中使用噬菌体治疗金黄色葡萄球菌肺炎获得一些成功的结果。例如，Oduor等 [49] 发现噬菌体比克林霉素治疗小鼠血源性耐多药肺炎更有效。同样，噬菌体疗法也是治疗金黄色葡萄球菌VAP的一种有希望的替代和/或补充策略。事实上，给感染小鼠静脉应用替考拉宁或四种噬菌体混合剂其存活率分别提高到50% 和58%[50]。此外，作为VAP的预防和治疗，细菌噬菌体雾化减少了肺内细菌负荷，提高了感染大鼠的存活率[51, 52]。一种含有感染金黄色葡萄球菌的三种溶解性肌尾噬菌体的混合剂，AB-SA01，最近也在急性肺炎小鼠模型中进行了评估。AB-SA01的有效性与万古霉素相似 [53]。基于这些结果，关于治疗几种葡萄球菌感染的I/II期临床试验已经开始。然而，目前还没有关于肺炎治疗的具体试验。最后，一个案例研究报道了1例囊性纤维化患者使用脓疱噬菌体制剂 (5个噬菌体，主要针对于金黄色葡萄球菌、酿脓链球菌、奇异变形杆菌、普通变形杆菌、铜绿假单胞菌、大肠杆菌) 和金黄色葡萄球菌噬菌体Sb-1。重要的是，噬菌体雾化应用后没有观察到不良事件。此外，治疗导致细菌细胞计数急剧减少，尽管没有达到完全根除 [54]。

尽管噬菌体治疗有潜在的获益，但为了促进其临床应用，还需要克服一些困难。这种挑战与选择最合适的噬菌体递送方法相关(图2)。例如，噬菌体雾化比静脉给药更有效，因为后者更可能刺激中和抗体的产生 [55]。Prazak等 [52] 发现联合应用噬菌体雾化和噬菌体静脉内应用可以挽救90% VAP大鼠。另一方面，由噬菌体引起的免疫刺激可能在肺炎患者应激肺部中适得其反。Dufor等 [56] 发现健康鼠鼻内应用两个大肠杆菌噬菌体促进了肺中抗病毒细胞因子 (γ-干扰素和interleukin-12) 和趋化因子的微弱增加，而在给予感染动物噬菌体治疗后则未观察到过度炎症。感染金黄色葡萄球菌和肺炎链球菌的噬菌体是否也是这种情况仍有待确定。

遗憾的是关于使用噬菌体衍生产品治疗人类肺炎的数据仍然很少。作者在 [57] 中描述了该领域为数不多的研究之一，他们评估了噬菌体对不同病原体引起的肺炎患者的疗效。80% 多个病例的治疗显示成功，证明了所选择的治疗潜力。

噬菌体衍生性溶解蛋白

除了噬菌体本身外，噬菌体溶菌素也是抗肺部感染的有价值武器 (由 [58] 综述)。当添加外源性革兰阳性菌时，这些噬菌体编码的蛋白水解细菌细胞壁中的肽聚糖，显示出有趣的特性，例如缺乏细菌耐药性形成以及其具有的高抗菌作用。到目前为止，在体外和体内已经对几种内溶素进行了鉴定，并成功地进行了抗肺炎链球菌的试验。值得注意的是，溶解素Cpl-1在不同的感染动物模型中已显示出治疗的潜力 [59]，有时与抗生素联用 [60] 或与另一种溶解素 (Pal)联用 [61]。类似地，溶解素Cpl-7显示出对几种细菌的杀菌活性 [62]，这可能通过逆转其细胞壁结合域的净电荷而得到进一步改善 [63]。事实上，在鼻咽部定植的动物模型中，嵌合蛋白Cpl-711和PL3比它们的亲代溶解蛋白更有效 [64]。此外，这些蛋白质在不同的实验中显示出协同的裂解活性，无论是在体外 (包括生物膜降解) 还是在体内成年斑马鱼肺炎球菌感染模型 [65]。Cpl-711和两种抗生素 (阿莫西林和头孢噻肟) 对多重耐药肺炎链球菌也有协同作用。甚至在小鼠和斑马鱼的脓毒症感染模型中，内溶素和头孢噻肟联合使用的疗效增加被得到证实 [66]。为了提高其活性，嵌合溶解素ClyJ通过缩短其连接体而被修饰，这导致体内溶解活性增加 (20倍) 并降低细胞毒性 [67]。值得注意的是，这种蛋白的一个变异体，ClyJ-3m，在结合胆碱后仍然是一个单体，表现出更高的杀菌活性和改善药代动力学特性，如免疫系统的清除率较低 [68]。此外，最近在口腔微生物组中发现了两种新的链球菌溶解素 (23TH_48和SA01_53)。其中一种是由感染婴儿链球菌的噬菌体编码的内溶素23TH_48，对几种分离的肺炎链球菌表现出溶解活性 [69]。

也有许多对金黄色葡萄球菌有效的噬菌体溶解素和嵌合蛋白 [70]，尽管它们中的大多数尚未用于治疗呼吸道感染的验证。然而，它们已被用于鼻部非定值菌，这对于预防金黄色葡萄球菌感染非常有用，尤其是那些手术后发生的感染 [71]。关于葡萄球菌性肺炎的治疗，[72] 在小鼠感染模型中所进行的研究中已显示了具有前景的结果。这些作者发现，在先前感染金黄色葡萄球菌的动物中，单次内溶素SAL200鼻内给药足以获得90-95% 的存活率。细胞内溶素与其他治疗物质联合治疗小鼠肺炎的疗效也已经过验证。例如，在内溶素LysGH15和芹菜素联用，显示出抗炎活性，在小鼠金葡菌肺炎模型中进行了评估，证明比LysGH15或芹菜素单用更有效 [73]。虽然金黄色葡萄球菌内溶素尚未得到治疗人类肺炎的验证，但正在进行几个其他抗葡萄球菌感染的临床试验 [70]。

关于内溶素的递药方式，研究仍然很少。最近，内溶素Cpl-1被装载到壳聚糖纳米颗粒中 [74]，并成功地在动物感染模型中进行了试验 [75]。Kaur等 [76] 也报道了一种基于壳聚糖藻酸盐的内溶素LysMR-5递药系统。这一领域的一个重要进展是通过雾化来传递内溶素。例如，Wang等 [77] 发现，网孔雾化后Cpl-1保持稳定，但在喷射雾化过程中失去活性。这一结果为开发能成功通过吸入给药的治疗产品开辟了新的可能性。

在噬菌体溶解素被广泛用作治疗药物之前，有必要证明其对人类的使用是否安全。在这种情况下，一些研究已经检查了这些蛋白质的临床前应用的安全性和毒性，但没有发现潜在毒性的明显迹象。例如，在人的巨噬细胞和咽部细胞暴露于内溶素Pal和Cpl-1中未观察到基因表达的变化。同样，促炎细胞因子水平保持不变，注射这些蛋白的动物未检测到补体激活。前30天IgG水平升高，而IgE水平保持稳定 [78]。