引起下呼吸道感染常见的病原体有细菌、病毒和非典型病原体等，目前常用于检测呼吸道病原体的方法有传统培养法和分子诊断方法。病毒和非典型病原体的检测已基本实现了分子诊断，而细菌的检测仍然以传统培养法为主。分子诊断方法不仅快速、敏感而且特异，而传统培养方法敏感性低、耗时长且受采样时是否已暴露于抗菌药物的影响较大，同时不同病原引起下呼吸道感染的定量阈值不同。因此，来自中日医院呼吸中心的研究团队试图建立一种多重定量PCR方法，来检测引起下呼吸道感染的12种细菌病原体（包括肺炎链球菌、流感嗜血杆菌、卡他莫拉菌、铜绿假单胞菌、肺炎克雷伯菌、鲍曼不动杆菌、阴沟肠杆菌、洋葱伯克霍尔德菌、大肠埃希菌、金黄色葡萄球菌、屎肠球菌和粪肠球菌），同时与临床诊断进行验证分析，以评估该方法的实验检测效能。
本研究主要分为两部分：第一部分是建立方法学，通过确定每个目标病原体的分子靶标并设计相应的引物和探针建立多重定量PCR分子诊断方法，同时通过最低检出限（LOD）、重复性、特异性和有效性等评估该多重定量PCR的性能。该诊断方法从采样到获取病原学结果仅需要2-3小时。第二部分为临床验证，通过收集下呼吸道感染患者的痰液和（或）支气管肺泡灌洗液（BALF），用传统培养法和多重定量PCR检测同一呼吸道样本，同时以传统培养法为诊断的金标准，计算多重定量PCR分子诊断方法的敏感性、特异性、阳性预测值和阴性预测值。此外，随机选取12例呼吸道样本进行多重定量PCR和二代测序（NGS）检测，评估他们检出的病原体是否一致。
第一部分：多重定量PCR的最低检出限（敏感性）是1000 copies/mL;该多重定量PCR分子诊断方法与非目标病原体无交叉反应发生，具有良好特异性；各检测指标的扩增效率（有效性）均在95%-100%之间，有效性较好；在重复性方面，阳性对照的检测阳性率均为100%，且CV%＜5%，阴性对照无扩增反应发生。
第二部分：本研究共收集下呼吸道样本211例，其中痰样本176例，支气管肺泡灌洗液35例。采样前7天内未静脉使用抗菌药物的是86例，已使用抗菌药物的是125例。社区获得性肺炎患者117例（55.5%），医院获得性肺炎患者20例（9.48%），慢性阻塞性肺疾病急性加重患者43例（20.4%）和支气管扩张并感染患者31例（14.7%）。
在211例下呼吸道样本中，传统培养法在63例样本中检出70个病原体（病原体检出率为29.9%），包括62个目标病原体和8个非目标病原体，63例样本中有7例检出两个病原体。在痰液中以细菌定量≥105 copies/mL或在BALF中细菌定量≥104 copies/mL作为多重定量PCR检测的阳性标准时，多重定量PCR在136例样本中检出192个目标病原体（病原体检出率为64.5%），包括肺炎链球菌（59/192，30.7%），铜绿假单胞菌（37/192，19.3%），流感嗜血杆菌（20/192，10.4%），鲍曼不动杆菌（15/192，7.8%），金黄色葡萄球菌（13/192，6.8%），卡他莫拉菌（10/192，5.2%），肺炎克雷伯菌（10/192,5.2%），以及洋葱伯克霍尔德菌、阴沟肠杆菌、大肠埃希菌（4/192，2.1%）。此外，还检出了粪肠球菌（13/192，6.8%）和屎肠球菌（11/192，5.7%）。多重定量PCR在35例样本中检出两个病原体，在9例样本中检出3个病原体，在1例样本中检出4个病原体（表1所示）。
表1 多重定量PCR检测下呼吸感染患者呼吸道样本中的病原体
多重定量PCR检出的病原体（n=192） | N (%) | 抗菌药物使用组 | 无抗菌药物 使用组 | P 值 |
肺炎链球菌（单病原体感染） | 43（22.4） | 9 | 34 | 0.000 |
肺炎链球菌+流感嗜血杆菌 | 5（2.6） | 3 | 2 | 1.000 |
肺炎链球菌+卡他莫拉菌 | 4（2.1） | 0 | 4 | 0.026 |
肺炎链球菌+肺炎克雷伯菌 | 1（0.5） | 0 | 1 | 0.408 |
肺炎链球菌+铜绿假单胞菌 | 3（1.6） | 0 | 3 | 0.066 |
肺炎链球菌+流感嗜血杆菌+金黄色葡萄球菌 | 2（1.0） | 0 | 2 | 0.165 |
肺炎链球菌+流感嗜血杆菌+铜绿假单胞菌 | 1（0.5） | 1 | 0 | 1.000 |
流感嗜血杆菌（单病原体感染） | 7（3.7） | 5 | 2 | 0.703 |
流感嗜血杆菌+铜绿假单胞菌 | 2（1.0） | 1 | 1 | 1.000 |
流感嗜血杆菌+鲍曼不动杆菌 | 1（0.5） | 1 | 0 | 1.000 |
流感嗜血杆菌+铜绿假单胞菌+金黄色葡萄球菌 | 1（0.5） | 1 | 0 | 1.000 |
流感嗜血杆菌+鲍曼不动杆菌+金黄色葡萄球菌 | 1（0.5） | 1 | 0 | 1.000 |
卡他莫拉菌（单病原体感染） | 6（3.1） | 1 | 5 | 0.042 |
金黄色葡萄球菌（单病原体感染） | 3（1.6） | 2 | 1 | 1.000 |
金黄色葡萄球菌+粪肠球菌 | 2（1.0） | 2 | 0 | 0.515 |
金黄色葡萄球菌+屎肠球菌+粪肠球菌 | 1（0.5） | 1 | 0 | 1.000 |
金黄色葡萄球菌+鲍曼不动杆菌 | 1（0.5） | 1 | 0 | 1.000 |
铜绿假单胞菌（单病原体感染） | 20（10.4） | 20 | 0 | 0.000 |
铜绿假单胞菌+大肠埃希菌 | 1（0.5） | 0 | 1 | 0.408 |
铜绿假单胞菌+鲍曼不动杆菌 | 4（2.1） | 4 | 0 | 0.147 |
铜绿假单胞菌+金黄色葡萄球菌 | 1（0.5） | 1 | 0 | 1.000 |
铜绿假单胞菌+屎肠球菌 | 1（0.5） | 1 | 0 | 1.000 |
铜绿假单胞菌+粪肠球菌 | 1（0.5） | 1 | 0 | 1.000 |
铜绿假单胞菌+鲍曼不动杆菌+粪肠球菌 | 1（0.5） | 1 | 0 | 1.000 |
铜绿假单胞菌+肺炎克雷伯菌+阴沟肠杆菌+粪肠球菌 | 1（0.5） | 1 | 0 | 1.000 |
鲍曼不动杆菌（单病原体感染） | 2（1.0） | 2 | 0 | 0.515 |
鲍曼不动杆菌+屎肠球菌 | 2（1.0） | 2 | 0 | 0.515 |
鲍曼不动杆菌+肺炎克雷伯菌 | 1（0.5） | 1 | 0 | 1.000 |
鲍曼不动杆菌+肺炎克雷伯菌+金黄色葡萄球菌 | 1（0.5） | 1 | 0 | 1.000 |
鲍曼不动杆菌+肺炎克雷伯菌+屎肠球菌 | 1（0.5） | 1 | 0 | 1.000 |
肺炎克雷伯菌（单病原体感染） | 3（1.6） | 3 | 0 | 0.272 |
肺炎克雷伯菌+屎肠球菌 | 2（1.0） | 2 | 0 | 0.515 |
洋葱伯克霍尔德菌（单病原体感染） | 1（0.5） | 1 | 0 | 1.000 |
屎肠球菌（单病原体感染） | 1（0.5） | 1 | 0 | 1.000 |
粪肠球菌（单病原体感染） | 5（2.6） | 5 | 0 | 0.081 |
粪肠球菌+屎肠球菌 | 2（1.0） | 2 | 0 | 0.515 |
屎肠球菌+大肠埃希菌 | 1（0.5） | 1 | 0 | 1.000 |
12例样本同时进行多重定量PCR和NGS检测，结果显示这两种分子诊断方法检出的病原体一致（表2所示）。
表2 比较NGS和多重定量PCR检测目标病原体
样本序号 | 多重定量PCR | NGS | 峰度排序 |
94 | 肺炎链球菌 | 肺炎链球菌 | 26 |
96 | 肺炎链球菌 | 肺炎链球菌 | 26 |
99 | 肺炎链球菌 | 肺炎链球菌 | 23 |
100 | 肺炎链球菌 | 肺炎链球菌 | 26 |
103 | 肺炎链球菌 | 肺炎链球菌 | 24 |
104 | 肺炎链球菌 | 肺炎链球菌 | 23 |
106 | 肺炎链球菌 | 肺炎链球菌 | 26 |
110 | 肺炎链球菌 | 肺炎链球菌 | 24 |
111 | 肺炎链球菌 | 肺炎链球菌 | 21 |
112 | 肺炎链球菌 和铜绿假单胞菌 | 肺炎链球菌 和铜绿假单胞菌 | 23和30 |
113 | 肺炎链球菌 | 肺炎链球菌 | 25 |
150 | 肺炎链球菌 | 肺炎链球菌 | 26 |
NGS：Next Generation Sequencing，二代测序
在125例已暴露于抗菌药物的样本中，多重定量PCR在79例（63.2%）样本中至少检出一个病原体，而传统培养法仅在37例（29.6%）样本中检出病原体（P＜0.01）。传统培养法检出最多的病原体是铜绿假单胞菌（n=17）和鲍曼不动杆菌（n=9），多重定量PCR检出最多的病原体也是铜绿假单胞菌（n=32）和鲍曼不动杆菌（n=15）。在86例未静脉使用抗菌药物的样本中，多重定量PCR在57例（66.3%）样本中检出至少一个病原体，而传统培养法仅在26例（30.2%）样本中检出病原体（P＜0.01）。传统培养法检出最多的病原体是肺炎克雷伯菌（n=8）和流感嗜血杆菌（n=6），而多重定量PCR检出最多的病原菌是肺炎链球菌（n=47）和卡他莫拉菌（n=9），如表3所示。
表3 在抗菌药物使用组和无抗菌药物使用组传统培养法和多重定量PCR检出的细菌数
病原菌 | 抗菌药物使用组 n=125 | 无抗菌药物使用组 n=86 | ||
传统培养法 | 多重定量PCR | 传统培养法 | 多重定量PCR | |
肺炎链球菌 | 0 | 12 | 4 | 47 |
流感嗜血杆菌 | 1 | 12 | 6 | 8 |
卡他莫拉菌 | 0 | 1 | 2 | 9 |
铜绿假单胞菌 | 17 | 32 | 4 | 5 |
鲍曼不动杆菌 | 9 | 15 | 0 | 0 |
肺炎克雷伯菌 | 5 | 9 | 8 | 1 |
阴沟肠杆菌 | 0 | 1 | 0 | 0 |
大肠埃希菌 | 2 | 1 | 1 | 1 |
洋葱伯克霍尔德菌 | 0 | 1 | 0 | 0 |
金黄色葡萄球菌 | 2 | 10 | 1 | 3 |
屎肠球菌 | 0 | 11 | 0 | 0 |
粪肠球菌 | 0 | 13 | 0 | 0 |
总数 | 36 | 118 | 26 | 74 |
本研究中以传统培养法作为诊断的金标准，多重定量PCR检测目标病原体的敏感性、特异性、阳性预测值和阴性预测值分别为77%(95%CI,67-88%)，94%(95%CI,93-95%)，25%(95%CI,19-31%)和99%(95%CI,99-100%)，如表4所示。
多重定量PCR分子诊断方法的建立使下呼吸道感染患者的细菌病原体的检出率从29.9%提高到了64.5%，且多重定量PCR比传统培养法检出了更多的细菌病原体共存病例。此外，多重定量PCR还能对所检测的病原体进行定量，对病原体的定量可以为临床区分定植和感染提供一定的科学依据，以肺炎链球菌为例，目前已有研究报道以细菌定量≥104 copies/mL或者≥105 copies/mL作为区分定植和感染的阈值，因此课题组下一步研究设想要对试剂盒中所有细菌致病剂量进行探索，为解决临床病原体定植与感染问题积累证据。多重定量PCR分子诊断方法比传统培养法更敏感和快速，可以对指导临床正确使用抗菌药物具有重要意义。
多重定量PCR分子诊断方法的应用，可以解决传统培养法检测部分下呼吸道感染相关细菌病原体的敏感性低、耗时长等问题，对临床减少广谱抗菌药物的使用从而减少耐药菌株的出现具有重要作用，且对减轻患者的经济负担及降低医疗成本具有巨大帮助。
本研究所用试剂由北京卓诚惠生生物科技股份有限公司提供。
表4多重定量PCR用于检测细菌的性能
病原体 | TP CC+=MQ-PCR+ | FP CC-=MQ-PCR+ | FN CC+=MQ-PCR- | TN CC-=MQ-PCR- | Se (%) [95%CI] | Sp (%) [95%CI] | PPV (%) [95%CI] | NPV (%) [95%CI] |
金黄色葡萄球菌 | 3 | 10 | 0 | 198 | 100 | 95 | 23 | 100 |
肺炎链球菌 | 4 | 55 | 0 | 152 | 100 | 73 | 7 | 100 |
屎肠球菌 | 0 | 11 | 0 | 200 | 0 | 95 | 0 | 100 |
粪肠球菌 | 0 | 13 | 0 | 198 | 0 | 94 | 0 | 100 |
大肠埃希菌 | 1 | 1 | 2 | 207 | 33 | 100 | 50 | 99 |
流感嗜血杆菌 | 4 | 16 | 3 | 188 | 57 | 92 | 20 | 98 |
卡他莫拉菌 | 2 | 8 | 0 | 201 | 100 | 96 | 20 | 100 |
铜绿假单胞菌 | 21 | 16 | 0 | 174 | 100 | 92 | 57 | 100 |
鲍曼不动杆菌 | 8 | 7 | 1 | 195 | 89 | 97 | 53 | 100 |
肺炎克雷伯菌 | 5 | 5 | 8 | 193 | 39 | 98 | 50 | 96 |
阴沟肠杆菌 | 0 | 1 | 0 | 210 | 0 | 100 | 0 | 100 |
洋葱伯克霍尔德菌 | 0 | 1 | 0 | 210 | 0 | 100 | 0 | 100 |
总数 | 48 | 144 | 14 |
2326
| 77% (95%CI,67-88%) | 94% (95%CI,93-95%) | 25% (95%CI,19-31%) | 99% (95%CI,99-100%) |
TP：True positive，真阳性；CC：Conventional culture，传统培养；FP： False positive，假阳性；FN：False negative，假阴性；TN：True negative，真阴性; PPV：Positive predictive value，阳性预测值；NPV：Negative predictive value，阴性预测值；CI：confidence interval，可信区间；Se：Sensitivity，敏感性；Sp：Specificity，特异性.
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